【求助】原位杂交道亚洲城ca88娱乐理、探针设计和尝试步调

来源:网络整理作者:亚洲城ca88 日期:2021/04/27 14:52 浏览:

原位杂交

原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry,ISHH) 简称原位杂交(InSitu Hybridization),属于固相分子杂交的领域,它是用标志的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的要领。按照所用探针和靶核酸的差异,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。按照探针的标志物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标志的探针与靶核酸举办杂交,杂交后别离通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促回响直接显示。间接法一般用半抗原标志探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。原位杂交最初是以同位素标志探针举办的。尽量同位素标志(如35S,3H,32P等)仍然遍及利用,但非同位素标志探针的迅速成长(尤其是生物素标志探针和地高辛标志探针),更引起科技事情者的极大乐趣。

一、根基要求

组织取材:组织取材应尽大概新鲜。由于组织RNA降解较快,所以新鲜组织和造就细胞最亏得30min内牢靠。
牢靠:目标是(1)保持细胞布局;(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的程度;(3)使探针易于进入细胞或组织。最常用的牢靠剂是多聚甲醛,与其它醛类牢靠剂(如戊二醛)差异,多聚甲醛不会与卵白质发生遍及的交错毗连,因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
加强组织的通透性和核酸探针的穿透性:(1)稀酸处理惩罚和酸酐处理惩罚:为防备探针与组织中碱性卵白之间的静电团结,以低落配景,杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理惩罚10min,经乙酸酐处理惩罚后,组织卵白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理惩罚10min,稀酸能使碱性卵白变性,团结卵白酶消化,容易将碱性卵白移除。(2)去污剂处理惩罚:去污剂处理惩罚的目标是增加组织的通透性,利于杂交探针进入组织细胞,最常应用的去污剂是Triton X-100。留意:太过的去污剂处理惩罚不只影响组织的形态布局,并且还会引起靶核酸的丢失。(3) 卵白酶处理惩罚:卵白酶消化能使经牢靠后被遮蔽的靶核酸袒露,以增加探针对靶核酸的可及性。常用的卵白酶有卵白酶K(proteinase K),尚有链霉卵白酶(pronase)和胃卵白酶(pepsin)等。
杂交缓冲液孵育:杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2hr,以阻断玻片和标本中大概与探针发生非特异性团结的位点,到达减低配景的目标。
防备污染:由于在手指皮肤及尝试室用玻璃器皿上均大概含有RNA酶,为防备其污染影响尝试功效,在整个杂交前处理惩罚进程中都需要戴消辣手套,尝试所用玻璃器皿及镊子都应于尝试前一日置高温烘烤(180℃)以到达消除RNA酶的目标。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理惩罚。
双链DNA探针和靶DNA的变性:杂交回响举办时,探针和靶核酸都必需是单链的。假如用双链DNA探针举办杂交(包罗检测RNA时),双链DNA探针
在杂交前必需举办变性。探针变性后要当即举办杂交回响,否则解链的探针又会从头复性。
杂交液:杂交液内除含必然浓度的标志探针外,还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白卵白及载体DNA或RNA等。杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加,可以减低探针与组织标本之间的静电团结。甲酰胺可使Tm低落,杂交液中含每1%的甲酰胺可别离使RNA:RNA,RNA:DNA,DNA:DNA的杂交温度低落0.35℃,0.5℃和0.65℃。所以,杂交液中插手适量的甲酰胺,可制止因杂交温渡过高而引起的组织形态布局的粉碎以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水团结,从而淘汰杂交液的有效容积,提高探针有效浓度,以到达提高杂交率的目标(尤其对双链核酸探针)。在杂交液中插手牛血清白卵白及载体DNA或RNA等,都是为了阻断探针与组织布局身分之间的非特异性团结,以减低配景。
探针的浓度:探针浓度依其种类和尝试要求略有差异,一般为0.5-5.0μg/ml(0.5-5.0ng/μl)。最适宜的探针浓度要通过尝试才气确定。
探针的长度:一般应在50-300个碱基之间,最长不宜高出400个碱基。探针短易进入细胞,杂交率高,杂交时间短。

二、试剂筹备

1. 0.1M PBS (pH7.2):Na2HPO4?12H2O 61.6g、NaH2PO4?2H2O 5.6g、NaCl 9g,加ddH2O至2000ml,高压灭菌。
2. 0.2M PB ((pH7.2):Na2HPO4?12H2O 61.6g、NaH2PO4?2H2O 5.6g 加ddH2O至1000ml,高压灭菌。
3. 0.1M甘氨酸:0.75g甘氨酸溶于0.1M PBS,定容至100ml,高压灭菌。
4. 4%多聚甲醛:多聚甲醛40g加ddH2O400ml,加热至70℃阁下,用1M NaOH调pH至7.0,用ddH2O定容至500ml,再加0.2M PB 500ml,总体积为1000ml。
5.16×Denhardt溶液:聚乙烯吡咯酮0.4g、小牛血清白卵白(BSA) 0.4g、聚蔗糖0.4g,加dd H2O至10ml,无菌抽滤、分装,-20℃生存备用。
6.预杂交液:去离子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml,于50℃促溶后,再依次插手16×Denhardt液0.2ml、1M Tris-HCl(pH 8.0) 0.2ml、5M NaCl 1.2ml、0.5M EDTA(pH 8.0) 0.04ml、0.1M二硫苏糖醇 2ml、ddH2O2.21ml,总体积为10ml。无菌抽滤、分装,-20℃生存备用。临用前插手50mg/ml变性鲑鱼精DNA 75μl/ml。
7. 20×SSC:NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g,加水至800ml,用2N NaOH调pH至7.0,再用ddH2O定容至1000ml。
8.抗体稀释液:TritonX-100 80μl、BSA 0.2g,以0.05M PBS定容至20ml。
9. TSM1:1M Tris-HCl(pH 8.0)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml,加ddH2O 100ml。
TSM2(新鲜配制):1M Tris-HCl(pH 9.5)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml,加ddH2O至100ml。
显色液(临用前现配):5mlTSM2 加显色液原液(NBT/BCIP)150μl,并加适量左旋咪唑使其终浓度为0.24μg/ml,避光。

三、操纵步调

(一)取材、冰冻切片:
将动物以3%戊巴比妥钠麻醉,打开胸腔,亚洲城ca88娱乐,袒露心脏,刺破右心耳,将针尖刺入左心室用生理盐水灌注(灌注量约为动物体重的2倍),再注入等量的4%多聚甲醛。(见图2-7)。取材,置于4%多聚甲醛中后牢靠4hr。以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次(换液:1次/hr)。将组织块入30%蔗糖/0.1MPBS液(4℃),1-2天后冰冻切片,将切片裱贴于原位杂交专用玻片上,切片厚度为15-20μm。

(二)探针制备与检测(定量):
1.随机引物制备cDNA核酸探针
以DIG DNA 标志检测试剂盒为例:
(1)探针制备:
①模板DNA(0.5-3μg) 15μl,100℃变性10min,冰浴5 min。
②在冰浴中加:Hexanucleotide mix 2μl, dNTPmix 2μl, KlenowEnzyme 1μl,回响总体积为20μl。37℃孵育留宿。
③在上述20μl的标志产品中加4M LiCl 2.5μl, 75μl(无水乙醇预冷),轻轻混匀,-20℃安排 2hr。4℃离心12000g×15min,弃上清。70%乙醇(预冷) 50μl洗涤,7500g×5min,弃上清,晾干沉淀,加TE 50μl溶解沉淀,-20℃生存备用。
(2)探针敏感性检测:
①样品稀释:取dig-标志探针1μl 用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀释。
②取一张与点样器巨细临近的尼龙膜,标志偏向,ddH2O中浸泡 1min,6×SSC中浸泡10min,置点样器上,负压抽吸5min。
③将上述样品点于尼龙膜上,继承抽吸10min。
④取下尼龙膜,置紫外灯下10cm处照射5min,晾干。
⑤将膜置于适量预杂交液(5-10 ml)中,37℃预杂交10min。
⑥插手Anti-dig 抗体(1:5000),37℃杂交30min。
⑦洗膜:2×SSC/0.1%SDS室温洗10 min×2次。
⑧显色:15 mlTSM2中加300μl显色液(NBT/BCIP),37℃避光显色30min。

1. PCR法制备cDNA核酸探针:
(1)探针制备:
以PCR DIGProbe Synthesis Kit 为例:
在0.5ml离心管中,依次插手:
PCR 引物 1(10pM) 2μl
PCR 引物 1(10pM) 2μl
质粒DNA 模板(10-100pg) 2μl
PCR DIG mix 2μl
(含dNTP和DIG-11-dUTP)
dNTPmix 2μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶(2u/μl) 1μl
插手适量ddH2O,使总体积达50μl。
①将上述殽杂液稍加离心,当即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入轮回扩增阶段:93℃ 45s → 58℃45s → 72℃60s,轮回30-35次,最后在72℃保温7min。
②在上述PCR产品中插手4M LiCl 12.5μl、预冷无水乙醇375μl,轻轻殽杂后置于-20℃2hr, 12,000g×15min,弃上清。70%乙醇(预冷) 120μl洗涤沉淀,离心7500g×5min,弃上清,晾干沉淀,加TE 50μl溶解,-20℃生存备用。
(2)探针检测:
行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下调查DIG-DNA探针含量(回收目测法)。

(三)原位杂交回响(以DIG-cDNA探针为例):
1.0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
2.0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
3.0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
4.0.1M PBS 洗 5min×3次,加卵白酶K(1μg/ml),37℃孵育30 min。
5. 4%多聚甲醛浸5min。
6. 0.1M PBS 洗 5min×2次,浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
7.预杂交:滴加适量预杂交液,42℃ 30 min。
1.杂交:倾去预杂交液,在每张切片上滴加10-20μl杂交液(将探针变性后稀释在预杂交液中,0.5 ng/μl ),覆以盖玻片或蜡膜,42℃留宿。(阴性比较
2.洗片:
(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min;
0.2×SSC 37℃洗10min;0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min;
0.05M PBS 洗 5min×2次。
10.3% BSA/0.05M PBS 包被,37℃ 30min.
11.滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物(以抗体稀释液1:5000稀
释)4℃孵育留宿。
12. 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM210min×2次。
13.显色:在玻片上滴加适量显色液,4℃避光留宿。
14.将玻片置于TE中10-30min以终止回响。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂,中性树胶封片。
15.显微镜下调查功效。

四、留意事项:

1.作为DNA-RNA的杂交,需防RNase的污染。
cDNA探针在杂交时必需变性解链。详细要领是:将探针置100℃加热5min,冰浴骤冷。